Wat is sulforafaan?

sulforafaan is een fytochemische stof, een stof binnen de isothiocyanaatgroep van organozwavelverbindingen, aangetroffen in kruisbloemige groenten, zoals broccoli, kool, bloemkool en spruitjes. Het kan ook worden gevonden in paksoi, boerenkool, collards, mosterdgroenten en waterkers. Onderzoeksstudies hebben aangetoond dat sulforafaan verschillende vormen van kanker kan helpen voorkomen activeren van de productie van Nrf2, of nucleaire factor erytroïde 2-gerelateerde factor, een transcriptiefactor die beschermende antioxidantmechanismen reguleert die de reactie van de cel op oxidanten regelen. Het doel van het volgende artikel is om de functie van sulforafaan te beschrijven.

Abstract

Het KEAP1-NrF2-ARE antioxidantensysteem is een belangrijk middel waarmee cellen reageren op oxidatieve en xenobiotische spanningen. Sulforaphane (SFN), een elektrofiel isothiocyanaat afgeleid van kruisbloemige groenten, activeert de KEAP1-NrF2-ARE-route en is een moleculair belang geworden bij de behandeling van ziekten waarbij chronische oxidatieve stress een belangrijke etiologische rol speelt. We demonstreren hier dat de mitochondriën van gekweekte, humane retinale pigmentepitheelcellen (RPE-1) die met SFN worden behandeld, een hyperfusie ondergaan die onafhankelijk is van zowel Nrf2 als zijn cytoplasmatische remmer KEAP1. Mitochondriale fusie is naar verluidt cytoprotectief door het remmen van porievorming in mitochondria tijdens apoptose, en in overeenstemming hiermee laten we Nrf2-onafhankelijke cytoprotectie zien van met SFN behandelde cellen die zijn blootgesteld aan de apoptose-inductor, staurosporine. Mechanistisch compenseert SFN de rekrutering en / of retentie van de oplosbare splijtingsfactor Drp1 naar mitochondria en peroxisomen, maar heeft geen invloed op de algehele overvloed van Drp1. Deze gegevens tonen aan dat de gunstige eigenschappen van SFN verder reiken dan de activering van het KEAP1-Nrf2-ARE-systeem en verdere ondervraging rechtvaardigen gezien het huidige gebruik van dit middel in meerdere klinische onderzoeken.

sleutelwoorden: Sulforaphane, Nrf2, Drp1, Mitochondria, Fission, Fusion, Apoptosis

Introductie

Sulforaphane is een Nrf2-onafhankelijke remmer van mitochondriale splijting

Sulforafaan (SFN) is een isothiocyanaatverbinding afgeleid van het dieet dat het meest voorkomt uit kruisbloemige groenten [56]. Het wordt gegenereerd in planten als een xenobiotische reactie op predatie via vesiculaire afgifte van het hydrolytische enzym myrosinase uit beschadigde cellen; dit enzym zet glucosinolaten om in isothiocyanen [42]. In de afgelopen twee decennia is SFN uitgebreid gekarakteriseerd vanwege de gerapporteerde antikanker-, antioxidant- en antimicrobiële eigenschappen [57]. Veel van deze werkzaamheid is toegeschreven aan het vermogen van SFN om de KEAP1-Nrf2-antioxidant responselement (ARE) signaalroute te moduleren, hoewel aanvullende activiteiten van de verbinding zijn geïdentificeerd, waaronder de remming van histondeacetylase-activiteit en celcyclusprogressie [ 29]. Nrf2 is de meest belangrijke transcriptiefactor voor antioxidanten en onder omstandigheden van homeostase wordt de stabiliteit ervan onderdrukt door de werking van het cytoplasmische Cullin3KEAP1 ubiquitine-ligasecomplex [20]. In het bijzonder wordt Nrf2 gerekruteerd naar de Cullin3KEAP1-ligase door binding aan de dimere substraatadapter KEAP1 en wordt vervolgens gemodificeerd met polyUb-ketens die de transcriptiefactor voor proteasoom-gemedieerde afbraak richten. Deze constitutieve turnover beperkt de halfwaardetijd van Nrf2 in onbeklede cellen tot ~ 15 min [30], [33], [46], [55]. In reactie op talrijke soorten stress, met name oxidatieve stress, werkt KEAP1, een cysteïnerijk proteïne, als een redoxsensor, en oxidatieve modificatie van kritieke cysteïnes, met name C151, van KEAP1 dissocieert Nrf2-KEAP1 van CUL3 waardoor Nrf2-degradatie wordt voorkomen [ 8], [20], [55]. Met name SFN en mogelijk andere Nrf2-activatoren bootsen oxidatieve stress na door C151 van KEAP1 te wijzigen, bijvoorbeeld [21]. Stabilisatie van Nrf2 zorgt voor de translocatie naar de kern waar het de expressie induceert van een batterij van Phase II antioxidant- en detoxificatiegenen. Nrf2 bindt zich aan de antioxidantresponspromotorelementen (ARE) van zijn verwante doelwitgenen door heterodimerisatie met kleine Maf-eiwitten [19]. Dit systeem presenteert een dynamische en gevoelige reactie op indirecte antioxidanten zoals SFN, vrije radicalen gegenereerd door de mitochondria [16] of andere fysiologische bronnen van oxidatieve stress [41].

Mitochondria zijn dynamische, subcellulaire organellen die een groot aantal cellulaire functies regelen, gaande van ATP-productie en intracellulaire calciumbuffering tot redoxregulatie en apoptose [13], [49]. Mitochondria vertegenwoordigen ook de belangrijkste bron van reactieve zuurstofspecies (ROS) in de cel. Een goede regulering van de mitochondriale functie is daarom noodzakelijk voor het optimaliseren van de productie van ATP om aan de cellulaire behoeften te voldoen, terwijl tegelijkertijd de potentieel schadelijke effecten van overmatige productie van vrije radicalen worden geminimaliseerd. Een cruciale vereiste voor fijne modulatie van de mitochondriale functie is het vermogen van mitochondriën om zowel onafhankelijk als biochemische machines te functioneren en als onderdeel van een uitgebreid, responsief netwerk.

De morfologie en functie van het mitochondriale netwerk worden bepaald door een gereguleerd evenwicht tussen kernsplijting en fusie. Mitochondriale fissie is vereist voor de overerving van mitochondriën door dochtercellen tijdens celdeling [28] evenals voor de selectieve, autofagische afbraak van gedepolariseerde of beschadigde mitochondriën, genaamd mitofagie [1]. Omgekeerd is fusie vereist voor het complementeren van mitochondriale genomen en het delen van componenten van de elektronentransportketen tussen naburige mitochondria [54]. Op moleculair niveau worden mitochondriale fissie en fusie gereguleerd door grote, dynamineachtige GTPasen. Drie enzymen reguleren voornamelijk fusie: Mitofusins ​​1 en 2 (Mfn1 / 2) zijn twee passerende buitenmembraaneiwitten die buitenmembraan fusie bemiddelen via heterotypische interacties tussen aangrenzende mitochondria [15], [25], [37], terwijl OPA1 een innerlijke is membraaneiwit dat tegelijkertijd zorgt voor matrixconnectiviteit door het samensmelten van binnenmembranen [5] te reguleren. De GTPase-activiteit van alle drie de eiwitten is vereist voor robuuste fusie [5], [18] en OPA1 wordt verder gereguleerd door complexe proteolyse in het mitochondriale binnenmembraan door de proteasen OMA1 [14], PARL [6] en YME1L [45 ]. Belangrijk is dat intact mitochondriaal membraanpotentieel vereist is voor efficiënte fusie om de integratie van beschadigde en gezonde mitochondria [26] te onderdrukken.

Mitochondriale fissie wordt voornamelijk gekatalyseerd door een cytosolisch eiwit genaamd Dynaminegerelateerd eiwit 1 (Drp1 / DNM1L). Drp1 wordt gerekruteerd uit het cytosol naar mogelijke plaatsen van splijting op het mitochondriale buitenmembraan [43]. De belangrijkste receptoren voor Drp1 op het buitenmembraan zijn mitochondriale fissiefactor (Mff) [32] en, in mindere mate, Fission 1 (Fis1) [51]. Daarnaast werd een lok-receptor, MIEF1 / MiD51, ontdekt die werkt om de activiteit van Drp1-eiwit op potentiële splijtingsites [58] verder te beperken. Eenmaal gekoppeld aan de mitochondriale buitenmembraan, oleriseert Drp1 in spiraalachtige structuren rond het lichaam van de mitochondrion en maakt vervolgens gebruik van de energie die is afgeleid van GTP-hydrolyse om de fysieke splitsing van de mitochondriale buitenste en binnenste membranen [17] te bewerkstelligen. Endoplasmatisch reticulum-afgeleide tubuli werken als een eerste constrictor van mitochondriën voorafgaand aan Drp1 oligomerisatie, wat de openbaring onderstreept dat niet-ingesnoerde mitochondriën breder zijn dan de toegestane omtrek van een voltooide Drp1-spiraal [12]. Actinedynamica is ook belangrijk voor de ER-mitochondria-interacties die voorafgaan aan mitochondriale splijting [24]. Naast zijn rol in mitochondriale fissie katalyseert Drp1 de splijting van peroxisomen [40].

Drp1 lijkt sterk op het goed gekarakteriseerde dynamineproteïne omdat beide eiwitten een N-terminaal GTPase-domein bevatten, een middelste domein dat van cruciaal belang is voor zelfoligomerisatie en een C-terminaal GTPase-effectordomein [31]. Drp1 bereikt selectiviteit voor mitochondriale membranen door een combinatie van interacties met zijn receptoreiwitten Mff en Fis1 en ook door zijn affiniteit voor het mitochondria-specifieke fosfolipide cardiolipine via het unieke B-insert domein van Drp1 [2]. Drp1 bestaat meestal als een homotetrameer in het cytoplasma en assemblage op hogere orde op mitochondriale fissiepunten wordt gemedieerd door het middelste domein van Drp1 [3].

Gezien de impliciete link tussen de mitochondriale functie en de KEAP1-Nrf2-ARE-route, onderzochten we de effecten van Nrf2-activering op de mitochondriale structuur en functie. We demonstreren hier dat SFN mitochondriale hyperfusie induceert die, onverwacht, onafhankelijk is van zowel Nrf2 als KEAP1. Dit effect van SFN is door een remming van de Drp1-functie. We demonstreren verder dat SFN resistentie verleent tegen apoptose die Nrf2-onafhankelijk is en die de waargenomen cellen nabootst die zijn verarmd door Drp1. Deze gegevens geven gezamenlijk aan dat naast het stabiliseren en activeren van Nrf2, SFN de mitochondriale dynamiek moduleert en de cellulaire conditie en overleving behoudt.

Resultaten

Sulforafaan induceert Nrf2/KEAP1-onafhankelijke hyperfusie van mitochondriën

Tijdens het bestuderen van de effecten van Nrf2-activering op de dynamiek van het mitochondriale netwerk, ontdekten we dat behandeling van onsterfelijk gemaakte, menselijke retinale pigmentepitheelcellen (RPE-1) met sulforafaan (SFN), een krachtige activator van Nrf2-signalering, een robuuste fusie veroorzaakte van het mitochondriale netwerk in vergelijking met met drager behandelde controlecellen (Fig. 1A en B). De morfologie van de mitochondriën in deze cellen leek sterk op die van de mitochondriën in cellen die waren uitgeput door siRNA van endogeen Drp1, de belangrijkste mitochondriale splitsingsfactor (Fig. 1A). Dit resultaat bracht het intrigerende idee naar voren dat de mitochondriale splijtings- en fusiestatus direct reageert op Nrf2-niveaus in de cel. Stimulatie van cellen met andere Nrf2-stabilisatoren en activatoren zoals de proteasoomremmer MG132, de pro-oxidant tBHQ of knockdown van de Nrf2-remmer KEAP1 induceerde echter geen mitochondriale fusie (Fig. 1A en B). Stabilisatie van Nrf2 door deze manipulaties werd bevestigd door western blotting voor endogeen Nrf2 (Fig. 1C). Bovendien was expressie van Nrf2 overbodig voor SFN-geïnduceerde mitochondriale fusie, omdat knockdown van endogeen Nrf2 met siRNA dit fenotype niet kon tegengaan (figuur 1D F). Omdat SFN de KEAP1-Nrf2-ARE-route stimuleert door cysteïneresiduen van KEAP1 [21] covalent te modificeren, hebben we KEAP1 uitgeschakeld om te onderzoeken of SFN-geïnduceerde mitochondriale hyperfusie wordt gestimuleerd via een KEAP1-afhankelijke, maar Nrf2-onafhankelijke route. De uitputting van KEAP1 kon echter ook de door SFN geïnduceerde mitochondriale fusie niet opheffen (figuur 1G I). In feite keerde SFN de profissiemorfologie om die werd geïnduceerd door uitputting van KEAP1 (Fig. 1G, paneel b versus paneel d). Deze resultaten geven aan dat SFN-behandeling mitochondriale fusie veroorzaakt, onafhankelijk van de canonieke KEAP1-Nrf2-ARE-route, en leidde ons tot het ondervragen of SFN rechtstreeks invloed heeft op componenten van de mitochondriale splijtings- of fusiemachines.

Sulforafaan schaadt de mitochondriale vereniging van Drp1

Gebaseerd op de bevinding dat SFN-behandeling mitochondriale hyperfusie induceert, redeneerden we dat dit fenotype een gevolg was van overmatige fusieactiviteit of een remming van fissie-activiteit. Om onderscheid te maken tussen deze twee mogelijkheden, vergeleken we de morfologie van peroxisomen in de aanwezigheid en afwezigheid van SFN. Peroxisomen lijken op mitochondriën omdat ze dynamische organellen zijn waarvan de vorm en lengte constant in beweging zijn [44]. Peroxisomen bevatten zowel Fis1 als Mff in hun buitenmembraan en zijn als gevolg daarvan doelen voor door Drp1 gemedieerde fissie [22], [23]. Peroxisomen maken echter geen gebruik van de fusie-machine van het mitochondriale netwerk en ondergaan daarom geen fusie [39]. Integendeel, peroxisomale fissie wordt tegengewerkt door de verlenging van bestaande peroxisomen via de novo toevoeging van membranen en eiwitten [44]. Omdat peroxisomen geen Mfn1 / 2 en OPA1 hebben, redeneerden we dat als SFN de fusiemachines activeert in plaats van de splijtingsmachines te remmen, de peroxisoomlengte niet zou worden beïnvloed. In met drager behandelde cellen worden peroxisomen gehandhaafd als korte, ronde, puntvormige organellen (Fig. 2, panelen b en d). Echter, SFN-behandeling verhoogde de peroxisoomlengte met ~ 2-vouw in vergelijking met controlecellen (Fig. 2, panelen f en h). Bovendien werden veel van de peroxisomen dicht bij het midden geknepen, wat wijst op een mogelijk scheurdefect (Fig. 2, paneel h, pijlpunten). Evenzo waren peroxisomen in cellen getransfecteerd met Drp1 siRNA abnormaal lang (Fig. 2, panels j en l), wat bevestigt dat Drp1 vereist is voor peroxisomale splijting en suggereert dat SFN-behandeling mitochondriale en peroxisomale fenotypen veroorzaakt door de splijtingsmachinerie te verstoren.

Vervolgens hebben we bepaald hoe SFN de Drp1-functie beperkt. Mogelijkheden waren onder meer verlagingen van expressieniveaus, rekrutering / retentie bij mitochondriën, oligomerisatie of enzymatische activiteit van het GTPase. Een tekort in een van deze zou resulteren in verminderde mitochondriale splijting en hyperfusie. We hebben geen reproduceerbare veranderingen in Drp1-eiwitniveaus gedetecteerd na SFN-behandeling (Fig. 1C en 3A), en concludeerden daarom dat SFN de stabiliteit of expressie van Drp1 niet verandert, consistent met Drp1 met een halfwaardetijd van> 10 uur [50] en onze SFN-behandelingen zijn van kortere duur. Vervolgens hebben we onderzocht of SFN de rekrutering of retentie van Drp1 naar mitochondriën beïnvloedde. Fractioneringsstudies toonden aan dat SFN een verlies van Drp1 uit de mitochondriale fractie induceerde (Fig. 3A, lanen 7-8 en Fig. 3B). Zoals eerder gemeld [43], is slechts een kleine fractie van Drp1 (~ 3%) op elk willekeurig moment geassocieerd met het mitochondriale netwerk tijdens steady-state-omstandigheden, waarbij het grootste deel van het enzym zich in het cytoplasma bevindt (Fig. 3A, banen 5 ). Deze fractioneringsgegevens werden bevestigd met behulp van co-lokalisatie-analyse die een reductie van ~ 8% liet zien in mitochondriën-gelokaliseerde, puntvormige Drp40-foci na SFN-behandeling (Fig. 1C en D). Samen geven deze gegevens aan dat de mitochondriale fusie geïnduceerd door SFN, althans gedeeltelijk, te wijten is aan de verzwakte associatie van Drp3 met de mitochondriën. Onze gegevens maken geen onderscheid tussen of SFN interfereert met de mitochondriale rekrutering versus de mitochondriale retentie van Drp1 of beide, aangezien de analyse van endogene Drp1 niet geschikt was om de GTPase te visualiseren door middel van live-celmicroscopie.

Sulforafaan geeft bescherming tegen door staurosportine geïnduceerde apoptose onafhankelijk van Nrf2

Eerder werk heeft aangetoond dat mitochondriale splijting toelaatbaar is bij de vorming van poriën in het buitenste mitochondriale membraan gegenereerd door Bax/Bak tijdens apoptose [11]. Het is aangetoond dat Drp1 selectief wordt gerekruteerd naar mitochondriën tijdens apoptose [11] en, in overeenstemming hiermee, zijn gefragmenteerde mitochondriën vroeg in het proces waargenomen [27]. Omgekeerd wordt aangenomen dat het remmen van mitochondriale splijting apoptose remt door de vorming van de buitenmembraanporiën te blokkeren die cytochroom c-afgifte mogelijk maken [53]. Dienovereenkomstig vertraagt ​​het stimuleren van mitochondriale fusie de progressie van apoptose die wordt geïnduceerd door verbindingen zoals staurosporine (STS) [14]. Om te bepalen of SFN RPE-1-cellen beschermt tegen STS-gemedieerde apoptose en zo ja, of dit Nrf2 vereist, hebben we een test opgezet om gemakkelijk poly ADP-ribosepolymerase (PARP) splitsing te induceren, een substraat van geactiveerd caspase-3 en definitieve marker van apoptose. Behandeling van RPE-1-cellen met 1 M STS gedurende 6 uur veroorzaakte slechts een zeer bescheiden splitsing van PARP, maar dit werd voorkomen door gelijktijdige SFN-behandeling (bijv. Fig. 4A, baan 3 versus 4). Om de robuustheid van deze test te vergroten, hebben we cellen verder gesensibiliseerd voor STS-geïnduceerde apoptose door ze voor te behandelen met siRNA gericht op de anti-apoptotische factor, Bcl-XL. Deze voorbehandeling verminderde de expressie van Bcl-XL en bevorderde duidelijk PARP-splitsing als een functie van de tijd blootgesteld aan STS (Fig. 4B, vergelijk baan 2 met banen 4-10). Belangrijk is dat 2 uur voorbehandeling met SFN PARP-splitsing in cellen die zijn blootgesteld aan STS verzachtte (Fig. 4C, baan 3 versus 4 en baan 5 versus 6). Evenzo werden cellen die door CRISPR / Cas2 stabiel waren uitgeput van Nrf9 op vergelijkbare wijze beschermd tegen STS-toxiciteit door SFN-voorbehandeling (Fig. 4C, baan 11 versus 12 en baan 13 versus 14 en Fig. 4D). Deze bescherming werd waargenomen met zowel PARP-splitsing (Fig. 4C en D) als cellulaire morfologie (Fig. 4E) als uitlezingen. De werkzaamheid van Nrf2-uitputting door CRISPR / Cas9 werd bevestigd door western-blotting (Fig. 4C, Nrf2-blot). Zoals voorspeld, blokkeerden uitputtende cellen van Drp1, die ook een hyperfusiefenotype opleveren (Fig. 1A), ook PARP-splitsing als reactie op STS in vergelijking met controlecellen die waren geïncubeerd met SFN (Fig. 4F en G). Samen zijn deze bevindingen consistent met SFN dat bescherming biedt tegen apoptose door zijn vermogen om de Drp1-functie te beperken, onafhankelijk van de stabilisatie en activering van Nrf2.

Discussie

We hebben ontdekt dat SFN mitochondriale fissie / fusiedynamiek moduleert, onafhankelijk van de effecten op de KEAP1-Nrf2-ARE-route. Dit is intrigerend vanwege een veronderstelde koppeling tussen mitochondriale dysfunctie en ROS-productie en de noodzaak om squelching mitochondria-afkomstige vrije radicalen door de activering van Nrf2. Deze extra functionele impact van SFN is van potentieel belang gezien de meer dan 30 klinische trials die momenteel aan de gang zijn en SFN testen voor de behandeling van een verscheidenheid aan ziekten, waaronder prostaatkanker, obstructieve longziekte en sikkelcelziekte [7], [10], [ 47].

Omdat SFN een isothiocyanaat is [56] en het Nrf2-signalering activeert door direct kritische KEAP1-cysteïnes te acyleren om Nrf2-degradatie [21] te onderdrukken, volgt hieruit dat SFN zijn pro-fusie-effecten uitoefent door de activiteit van een splijtings- of fusiefactor te moduleren via cysteïnemodificatie . Onze gegevens ondersteunen sterk dat Drp1 negatief wordt gereguleerd door SFN, hoewel het nog moet worden opgehelderd of de GTPase een direct doelwit van acylering is. Ondanks deze kenniskloof wordt de functie van Drp1 duidelijk aangetast door SFN, aangezien zowel mitochondriën als peroxisomen hyperfuseren als reactie op SFN-behandeling en deze organellen Drp1 delen voor hun respectievelijke splitsingsgebeurtenissen [38]. Bovendien vermindert SFN de hoeveelheid Drp1 die lokaliseert en zich ophoopt bij mitochondriën (Fig. 3). Omdat onze experimenten werden gedaan met alle endogene eiwitten, is onze detectie van Drp1 op mitochondriale splijtingsplaatsen onder stabiele omstandigheden, en bijgevolg kunnen we geen onderscheid maken tussen een rekruterings- versus een retentiedefect van het enzym veroorzaakt door SFN. Verder kunnen we de mogelijkheid niet uitsluiten dat SFN een receptor in de mitochondriën (Fis1 of Mff) acyleert om Drp1-rekrutering te blokkeren, we vermoeden dat Drp1 direct is gemodificeerd. Drp1 heeft negen cysteïnes, waarvan er acht zich bevinden in het middelste domein dat nodig is voor oligomerisatie [3], en waarvan er één zich bevindt in het GTPase Effector Domain (GED) aan de C-terminus van Drp1. Directe acylering van een van deze cysteïnes zou een activiteitsdefect in Drp1 kunnen veroorzaken en daarom ten grondslag liggen aan het effect van SFN op de mitochondriale dynamiek. Met name suggereert eerder werk dat defecten in oligomerisatie en katalytische activiteit de retentie van Drp1 in de mitochondriën kunnen tenietdoen [52]. Cys644 in het GED-domein is een bijzonder aantrekkelijk doelwit op basis van eerder werk dat aantoont dat mutatie van deze cysteïne mutaties kopieert die de Drp1-GTPase-activiteit [4] aantasten en dat deze specifieke cysteïne wordt gemodificeerd door thiol-reactieve elektrofielen [9]. Om deze openstaande vraag op te lossen, is massaspectrometrische validatie vereist. Samenvattend hebben we een nieuwe, cytoprotectieve functie geïdentificeerd voor de klinisch relevante verbinding SFN. Naast het activeren van de belangrijkste anti-oxidant transcriptiefactor Nrf2, bevordert SFN mitochondriale en peroxisomale fusie, en dit effect is onafhankelijk van Nrf2. Het mechanisme dat aan dit fenomeen ten grondslag ligt, omvat een vermindering van de functie van de GTPase Drp1, de primaire bemiddelaar van mitochondriale en peroxisomale splitsing. Een belangrijk gevolg van SFN-gemedieerde mitochondriale fusie is dat cellen resistent worden tegen de toxische effecten van de apoptose-inductor staurosporine. Deze aanvullende cytoprotectieve werking van SFN zou van bijzonder klinisch nut kunnen zijn bij de talrijke neurodegeneratieve ziekten waarvoor leeftijd de belangrijkste risicofactor is (bijv. de ziekte van Parkinson, de ziekte van Alzheimer, leeftijdsgebonden maculaire degeneratie), aangezien deze ziekten in verband zijn gebracht met apoptose en verminderd niveaus en / of ontregeling van Nrf2 [35], [36], [48].

Materialen en methoden

Apoptosis-assays

Cellen werden gezaaid en getransfecteerd met siRNA zoals hieronder aangegeven. De cellen werden gedurende 50 uur voorbehandeld met 2 µM sulforafaan om mitochondriale fusie te induceren en werden vervolgens behandeld met 1 µM staurosporine om apoptose te induceren. Op het moment van de oogst werden de media verzameld in afzonderlijke buisjes en onderworpen aan centrifugatie met hoge snelheid om apoptotische cellen te pelleteren. Deze celpellet werd gecombineerd met hechtende cellen en opgelost in 2 keer geconcentreerde Laemmli-buffer. Monsters werden onderworpen aan anti-PARP western blotting.

CRISPR / Cas9 Construct-generatie

Om LentiCRISPR / eCas9 1.1 te maken, werd LentiCRISPR v2 (addgene #52961) voor het eerst geknipt met Age1 en BamH1. Vervolgens werd SpCas9 van eSpCas9 1.1 (addegen # 71814) met PCR geamplificeerd met Age1 en BamH1 overhangen met behulp van de volgende primers (Forward AGCGCACCGGTTCTAGAGCGCTGCCACCATGGACTATAAGGACCACGAC, Reverse AAGCGCGGATCCCTTTTTCTTTTTTGCCTGGCCGG) en geligeerd in de snijvector hierboven. sgRNA-sequenties werden bepaald door Benchling.com te gebruiken. Parameters werden ingesteld om de coderende sequentie te targeten met de hoogste on-target en laagste off-target scores. De volgende sequenties (doelsequentie onderstreept hs sgNFE2L2 # 1 sense CACCGCGACGGAAAGAGTATGAGC, antisense AAACGCTCATACTCTTTCCGTCGC; hs sgNFE2L2 # 2 sense CACCGGTTTCTGACTGGATGTGCT, antisense AAACAGCACATCCAGTCAGAAACC; hs sgNFE2L2 # 3 sense CACCGGAGTAGTTGGCAGATCCAC, antisense AAACGTGGATCTGCCAACTACTCC) werden gekoppeld en geligeerd in BsmB1 gesneden LentiCRISPR / eCas9 1.1. Lentiviraal geïnfecteerde RPE-1-cellen werden geselecteerd met puromycine en gehandhaafd als een gepoolde populatie. Knockout werd bevestigd door immunofluorescentie en Western-blotting.

Celkweek en transfecties

Menselijke retinale pigmentepitheelcellen getransformeerd met telomerase (RPE-1) (ATCC) werden gekweekt in Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) met 1 g / l glucose aangevuld met penicilline, streptomycine, 1x niet-essentiële aminozuurcocktail (Life Technologies), en 10% foetaal runderserum (Life Technologies). Voor siRNA-transfecties werden 30,000-35,000 cellen / ml gedurende de nacht gezaaid. Cellen ontvingen 10 nM siRNA verdund in serumvrij DMEM en gecombineerd met 0.3% interferine-transfectiereagens (PolyPlus). Voor sensibilisatie van apoptose ontvingen cellen 1 nM Bcl-XL-siRNA. Cellen werden 2-3 dagen na transfectie geoogst.

Chemicaliën, antilichamen en siRNA Oligos

Antilichamen tegen β-tubuline (celsignalering), β-tubuline (Sigma), Drp1 (BD Biosciences), KEAP1 (Proteintech), Lamin B1 (Abcam), PARP (Cell Signaling), PMP70 (Abcam) en Tom20 (BD Biosciences) ) werden gebruikt in verdunningen van 1: 1000 voor western blotting en voor immunofluorescentie. Intern werd anti-Nrf2 konijnenantilichaam gebruikt in 1: 2000 voor western blotting [34], [59]. Sulforafaan (Sigma) en staurosporine (Tocris) werden gebruikt bij respectievelijk 50 µM en 1 µM. siRNA's tegen Drp1 (Dharmacon), Nrf2 (Dharmacon), KEAP1 (celsignalering) en Bcl-XL (celsignalering) werden gebruikt bij 10 nM tenzij anders vermeld.

Immunofluorescentie en in Vivo Labelling

Cellen gezaaid op glazen dekglaasjes van 18 mm werden behandeld met drager of medicijn, gefixeerd in 3.7% formaldehyde en vervolgens gedurende 0.2 minuten gepermeabiliseerd in 100% Triton X-10 / PBS op ijs. Primaire antilichamen werden een nacht bij 3 ° C geïncubeerd in 4% runderserumalbumine (BSA) in PBS. Na PBS-wasbeurten werden de cellen gedurende 1 uur geïncubeerd in soortgeschikte, Alexa488- of Alexa546-, geconjugeerde secundaire antilichamen (verdund 1: 1000) en 0.1 µg / ml DAPI (Sigma) in 3% BSA / PBS. Mitochondria werden zichtbaar gemaakt door ofwel anti-Tom20 immunofluorescentie ofwel door cellen te incuberen in 200 nM MitoTracker Red CMXRos (Molecular Probes, Inc.) in serumvrij DMEM gedurende 30 minuten bij 37 ° C voorafgaand aan fixatie.

Microscopie en beeldanalyse

Immunofluorescentiemonsters werden bekeken op een LSM710 confocale microscoop (Carl Zeiss). Microfoto's werden gemaakt met behulp van 63X of 100X olie-immersiedoelstellingen en afbeeldingen aangepast en verbeterd met Adobe Photoshop CS6. Co-lokalisatie-analyse werd uitgevoerd met behulp van de Carl Zeiss LSM710-co-lokalisatiefunctie met handmatig ingestelde drempels terwijl men blind was voor de identiteit van de monsters. Schaalbalken overal, tenzij anders aangegeven, zijn 10 m. Mitochondriale morfologie werd beoordeeld door middel van geblindeerde scores. Als de mitochondriën van een cel werden gehandhaafd als meerdere, ronde, onderscheiden puncta, werd de cel gescoord als splitsing . Als individuele mitochondriën niet te onderscheiden waren en het hele mitochondriale netwerk continu leek, werd de cel gescoord als fusie . Alle andere cellen, inclusief die met clusterende mitochondriën, werden gescoord als intermediair .

Subcellulaire fracties

RPE-1-cellen werden tot confluentie gekweekt. Na een PBS-wassing werden de cellen gedurende 600 minuten bij 10 gg gecentrifugeerd en opnieuw gesuspendeerd in 600 µl isolatiebuffer (210 mM mannitol, 70 mM sucrose, 5 mM MOPS, 1 mM EDTA pH 7.4 + 1 mM PMSF). De suspensie werd 30 keer gelyseerd in een Dounce-homogenisator. Een fractie van het homogenaat werd geconserveerd als een heel cellysaat De rest werd gedurende 800 minuten bij 10 g gecentrifugeerd om kernen te pelleteren. Supernatanten werden gedurende 1500 minuten bij 10 g gecentrifugeerd om de resterende kernen en niet-gelyseerde cellen te verwijderen. Dit supernatant werd gedurende 15,000 minuten bij 15 g gecentrifugeerd om mitochondriën te pelleteren. Het supernatant werd bewaard als de cytosolische fractie . De pellet werd voorzichtig gewassen met PBS en opnieuw gesuspendeerd in isolatiebuffer. De eiwitconcentratie van elke fractie werd gemeten met bicinchoninezuur (BCA) -test en equivalente hoeveelheden eiwit werden gescheiden door SDS-PAGE.

Western Blotting

Cellen werden gewassen in PBS en opgelost in 2 keer geconcentreerde Laemmli solubiliserende buffer (100 mM Tris [pH 6.8], 2% SDS, 0.008% broomfenolblauw, 2% 2-mercapto-ethanol, 26.3% glycerol en 0.001% Pyrinine Y). Lysaten werden 5 minuten gekookt voorafgaand aan het laden op natriumdodecylsulfaat (SDS) polyacrylamidegels. Eiwitten werden overgebracht naar nitrocellulosemembranen en de membranen werden gedurende 1 uur geblokkeerd in 5% melk/TBST. Primaire antilichamen werden verdund in 5% melk/TBST en een nacht bij 4 °C met de blot geïncubeerd. Met mierikswortelperoxidase (HRP) geconjugeerde secundaire antilichamen werden verdund in 5% melk/TBST. Blots werden verwerkt met verbeterde chemiluminescentie en densitometrische kwantificaties werden uitgevoerd met behulp van ImageJ-software.

Sulforafaan is een chemische stof uit de isothiocyanaatcollectie van organozwavelverbindingen verkregen uit kruisbloemige groenten, waaronder broccoli, kool, bloemkool, boerenkool en collards, onder andere. Sulforafaan wordt geproduceerd wanneer het enzym myrosinase glucoraphanine, een glucosinolaat, omzet in sulforafaan, ook bekend als sulforafaan-glucosinolaat. Broccolispruiten en bloemkool hebben de hoogste concentratie glucoraphanine of de voorloper van sulforafaan. Onderzoeksstudies hebben aangetoond dat sulforafaan de antioxidantvermogens van het menselijk lichaam verbetert om verschillende gezondheidsproblemen te voorkomen. Dr. Alex Jimenez DC, CCST Insight

Sulforafaan en de effecten ervan op kanker, mortaliteit, veroudering, hersenen en gedrag, hartaandoeningen en meer

Isothiocyanaten zijn enkele van de belangrijkste plantaardige stoffen die u in uw dieet kunt krijgen. In deze video maak ik de meest uitgebreide case voor hen die ooit is gemaakt. Korte aandachtsspanne? Ga naar uw favoriete onderwerp door op een van de onderstaande tijdspunten te klikken. Volledige tijdlijn hieronder.

Belangrijkste secties:

• 00: 01: 14 - Kanker en sterfte
• 00: 19: 04 - Veroudering
• 00: 26: 30 - Hersenen en gedrag
• 00: 38: 06 - Laatste overzicht
• 00: 40: 27 - Dosis

Volledige tijdlijn:

• 00: 00: 34 - Introductie van sulforafaan, een belangrijk aandachtspunt van de video.
• 00: 01: 14 - Kruisbloemige groenteconsumptie en verlagingen van mortaliteit door alle oorzaken.
• 00: 02: 12 - Risico op prostaatkanker.
• 00: 02: 23 - Blaaskankerrisico.
• 00: 02: 34 - Longkanker bij rokers risico.
• 00: 02: 48 - Risico op borstkanker.
• 00: 03: 13 - Hypothetisch: wat als je al kanker hebt? (Interventie)
• 00: 03: 35 - Aannemelijk mechanisme dat de associatieve gegevens over kanker en mortaliteit stuurt.
• 00: 04: 38 - Sulforafaan en kanker.
• 00: 05: 32 - Dierlijk bewijs dat een sterk effect van extract van broccolispruit toont op de ontwikkeling van blaastumoren bij ratten.
• 00: 06: 06 - Effect van directe suppletie van sulforafaan bij prostaatkankerpatiënten.
• 00: 07: 09 - Bioaccumulatie van isothiocyanaatmetabolieten in daadwerkelijk borstweefsel.
• 00: 08: 32 - Remming van stamcellen van borstkanker.
• 00: 08: 53 - Geschiedenisles: brassica's werden vastgesteld met gezondheidseigenschappen zelfs in het oude Rome.
• 00: 09: 16 - het vermogen van Sulforaphane om de kankerverwekkende uitscheiding te verbeteren (benzeen, acroleïne).
• 00: 09: 51 - NRF2 als een genetische switch via antioxidantresponselementen.
• 00: 10: 10 - Hoe NRF2-activering de carcinogene excretie via glutathion-S-conjugaten verbetert.
• 00: 10: 34 - Spruitjes verhogen glutathion-S-transferase en verminderen DNA-schade.
• 00: 11: 20 - Broccolispruitendrank verhoogt de benzeenuitscheiding met 61%.
• 00: 13: 31 - Broccoli-spruithomogenaat verhoogt antioxiderende enzymen in de bovenste luchtwegen.
• 00: 15: 45 - Kruisbloemige groenteconsumptie en sterfte aan hart- en vaatziekten.
• 00: 16: 55 - Broccolispruitpoeder verbetert de bloedlipiden en het algemene risico op hartziekten bij type 2 diabetici.
• 00: 19: 04 - Begin van het verouderingsgedeelte.
• 00: 19: 21 - Met Sulforaphane verrijkte voeding verlengt de levensduur van kevers van 15 tot 30% (onder bepaalde omstandigheden).
• 00: 20: 34 - Belang van lage ontsteking voor een lang leven.
• 00: 22: 05 - Kruisbloemige groenten en broccoli-kiempoeder lijken een breed scala aan ontstekingsmarkers bij mensen te verminderen.
• 00: 23: 40 - Mid-video samenvatting: kanker, verouderingssecties
• 00: 24: 14 - Muisstudies suggereren dat sulforaphane de adaptieve immuunfunctie op oudere leeftijd zou kunnen verbeteren.
• 00: 25: 18 - Sulforafaan verbeterde de haargroei in een muismodel van kalend. Afbeelding bij 00: 26: 10.
• 00: 26: 30 - Begin van de sectie hersenen en gedrag.
• 00: 27: 18 - Effect van extract van broccolispruiten op autisme.
• 00: 27: 48 - Effect van glucoraphanine op schizofrenie.
• 00: 28: 17 - Begin van depressie discussie (plausibel mechanisme en studies).
• 00: 31: 21 - Muisstudie met behulp van 10 verschillende modellen van stress-geïnduceerde depressie laten sulforafaan zien, even effectief als fluoxetine (prozac).
• 00: 32: 00 - Onderzoek toont aan dat directe inname van glucoraphanine bij muizen even effectief is bij het voorkomen van depressies als gevolg van een sociaal nederlaagstressmodel.
• 00: 33: 01 - Begin van de sectie neurodegeneratie.
• 00: 33: 30 - Sulforafane en de ziekte van Alzheimer.
• 00: 33: 44 - Sulforafane en de ziekte van Parkinson.
• 00: 33: 51 - De ziekte van Sulforaphane en Hungtington.
• 00: 34: 13 - Sulforafaan verhoogt heat shock-eiwitten.
• 00: 34: 43 - Begin van een traumatisch gedeelte over hersenletsel.
• 00: 35: 01 - Sulforafaan wordt geïnjecteerd onmiddellijk nadat TBI het geheugen verbetert (muisstudie).
• 00: 35: 55 - Sulforafaan en neuronale plasticiteit.
• 00: 36: 32 - Sulforafaan verbetert het leren in het model van type II diabetes bij muizen.
• 00: 37: 19 - Sulforafaan en duchenne spierdystrofie.
• 00: 37: 44 - Myostatinremming in spieratlanticellen (in vitro).
• 00: 38: 06 - Late video recapitulatie: sterfte en kanker, DNA-schade, oxidatieve stress en ontsteking, uitscheiding van benzeen, cardiovasculaire aandoeningen, type II diabetes, effecten op de hersenen (depressie, autisme, schizofrenie, neurodegeneratie), NRF2-route.
• 00: 40: 27 - Gedachten over het uitzoeken van een dosis broccoli of sulforafaan.
• 00: 41: 01 - Anekdotes over ontspruiten thuis.
• 00: 43: 14 - Op kooktemperaturen en sulforafaanactiviteit.
• 00: 43: 45 - Darmbacterieomzetting van sulforafaan uit glucoraphanine.
• 00: 44: 24 - Supplementen werken beter in combinatie met actieve myrosinase van groenten.
• 00: 44: 56 - Koken technieken en kruisbloemige groenten.
• 00: 46: 06 - Isothiocyanaten als goitrogens.

Danksagung

Sciencedirect.com/science/article/pii/S2213231716302750

Hoe wordt Sulforafaan geproduceerd?

Verhitting vermindert Epithiospecifier Protein Activity en verhoogt Sulforaphane Formation in Broccoli

Abstract

Sulforafaan, een isothiocyanaat uit broccoli, is een van de krachtigste van voedsel afgeleide anticarcinogenen. Deze verbinding is niet aanwezig in de intacte groente, maar wordt gevormd uit zijn glucosinolaatvoorloper, glucoraphanine, door de werking van myrosinase, een thioglucosidase-enzym, wanneer broccoliweefsel wordt fijngemaakt of gekauwd. Een aantal onderzoeken heeft echter aangetoond dat de sulforafaanopbrengst van glucoraphanine laag is, en dat een niet-bioactief nitrilanalogon, sulforafaannitril, het primaire hydrolyseproduct is wanneer plantenweefsel bij kamertemperatuur wordt vermalen. Recent bewijs suggereert dat in Arabidopsis de vorming van nitril uit glucosinolaten wordt gecontroleerd door een warmtegevoelig eiwit, epithiospecifier-eiwit (ESP), een niet-katalytische cofactor van myrosinase. Onze doelstellingen waren om de effecten te onderzoeken van het verwarmen van broccoliroosjes en spruiten op de vorming van sulforafaan en sulforafaannitril, om te bepalen of broccoli ESP-activiteit bevat, en om vervolgens warmteafhankelijke veranderingen in ESP-activiteit, sulforafaangehalte en bioactiviteit te correleren, zoals gemeten door inductie van de fase II ontgiftingsenzym chinonreductase (QR) in celcultuur. Het verwarmen van verse broccoliroosjes of broccolispruiten tot 60°C voorafgaand aan homogenisatie verhoogde tegelijkertijd de vorming van sulforafaan en verminderde vorming van sulforafaannitril. Een significant verlies van ESP-activiteit liep parallel met de afname van de vorming van sulforafaannitril. Verhitten tot 70 �C en hoger verminderde de vorming van beide producten in broccoliroosjes, maar niet in broccolispruiten. De inductie van QR in gekweekte muizenhepatoom Hepa lclc7-cellen gingen gepaard met een toename van de vorming van sulforafaan.

Voorverwarmen van broccoliroosjes en spruiten tot 60 C verhoogde de door myrosinase gekatalyseerde vorming van sulforafaan (SF) in plantaardige weefselextracten na het fijnmaken aanzienlijk. Dit ging gepaard met een afname van de vorming van sulforafaan nitril (SF Nitril) en de activiteit van epithiospecifier proteïne (ESP).

sleutelwoorden: Broccoli, Brassica oleracea, Cruciferae, Cancer, Anticarcinogen, Sulforaphane, Sulforaphane nitrile, Epithiospecifier protein, Quinone reductase

Kortom, sulforafaan is een fytochemische stof die wordt aangetroffen in broccoli en andere kruisbloemige groenten. Een ongecontroleerde hoeveelheid oxidanten, veroorzaakt door zowel interne als externe factoren, kan oxidatieve stress in het menselijk lichaam veroorzaken, wat uiteindelijk kan leiden tot een verscheidenheid aan gezondheidsproblemen. Sulforafaan kan de productie van Nrf2 activeren, een transcriptiefactor die helpt bij het reguleren van beschermende antioxidantmechanismen die de reactie van de cel op oxidanten regelen. De reikwijdte van onze informatie is beperkt tot chiropractische en spinale gezondheidsproblemen. Als u het onderwerp wilt bespreken, kunt u het aan Dr. Jimenez vragen of contact met ons opnemen via�915-850-0900 .

Curator van Dr. Alex Jimenez

Gerelateerd van: Sciencedirect.com

Bijkomend onderwerpbespreking: Acute rugpijn

Rugpijn is een van de meest voorkomende oorzaken van arbeidsongeschiktheid en gemiste werkdagen wereldwijd. Rugpijn is de tweede meest voorkomende reden voor doktersbezoeken, alleen overtroffen door bovenste luchtweginfecties. Ongeveer 80 procent van de bevolking zal gedurende zijn leven minstens één keer rugpijn ervaren. De wervelkolom is een complexe structuur die bestaat uit botten, gewrichten, ligamenten en spieren, naast andere zachte weefsels. Hierdoor kunnen verwondingen en / of verergerde omstandigheden, zoals herniated discs, kan uiteindelijk leiden tot symptomen van rugpijn. Sportblessures of ongevallen met auto-ongelukken zijn vaak de meest voorkomende oorzaak van rugpijn, maar soms kunnen de eenvoudigste bewegingen pijnlijke resultaten hebben. Gelukkig kunnen alternatieve behandelingsopties, zoals chiropractische zorg, de rugpijn verlichten door het gebruik van spinale aanpassingen en handmatige manipulaties, waardoor uiteindelijk de pijnverlichting wordt verbeterd.

EXTRA EXTRA | BELANGRIJK ONDERWERP: Aanbevolen El Paso, TX Chiropractor

***